论文标题：Cellular Taxonomy of the Mouse Striatum as Revealed by Single-Cell RNA-Seq
刊登日期：2016年07月
发表杂志：Cell Reports
影响因子：8.019
研究机构：斯坦福大学
1摘要纹状体是通往基底神经节回路的门户，有重要的运动调节功能。然而，其细胞分类尚不完全明确。本文作者发现，小鼠纹状体单细胞测序可将纹状体细胞较好的分为多种类型。单细胞转录组测序分析显示纹状体中有10种不同的细胞类型——神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、免疫细胞和血管细胞。此外，作者确定了两种中棘神经元(MSNs)的亚型，它们具有特定的maker基因。同时发现，marker基因Sp9过表达后与认知障碍和成瘾相关。作者同时还描述了在所有MSN亚型和星形胶质细胞表达谱的连续性，可能是转录多样性的基础。最后，作者鉴定了细胞亚型特异性的转录和剪接因子，它们通过调节剪接和表达模式来塑造特定的细胞亚型。该项研究表明，复杂组织中的功能多样性来自少量离散的细胞亚型，这些细胞亚型可以存在于连续的功能和状态中。
2背景小知识纹状体是通向基底神经节回路的重要通道，参与将皮层活动转换为适应性运动活动，纹状体功能障碍会导致很多神经精神疾病，包括帕金森病和亨廷顿病、精神分裂症、强迫症、成瘾和自闭症。纹状体中的主要投射神经元为中棘神经元(MSNs)，占纹状体所有神经元的90%-95%。基底神经节经典模型认为，MSN由两种具有相反功能的细胞亚型组成。D1型MSNs优先表达d1多巴胺受体并促进运动，而D2型MSNs主要表达D2-多巴胺受体并抑制运动。解剖学和功能证据表明，该模型虽然具有启发意义，但是可能需要通过纳入纹状体中棘神经元表型多样性的详细特征来加以修改。之前对纹状体多样性的研究要么是低维度的，测量单细胞中的少量转录本，要么依赖于汇集大量纹状体细胞进行大规模RNA测序，并模糊集合人群中的异质性，不能很好描述类纹状体细胞的多样性的分。单细胞转录组（scRNA-seq）的技术进步使描述组织的细胞多样性成为可能，并在小鼠和人的多种器官和组织中识别出不同的细胞亚型。在这项研究中作者对1208个纹状体细胞进行了scRNA-seq，重建了纹状体细胞的表型异质性。
3结果3.1 鉴定主要纹状体细胞类型作者使用两种互补的方法:微流控单细胞RNA测序(Mic-scRNA-seq)和流式分选单细胞测序(FACS-scRNA-seq)检测了分别来自D1-tdTomato (tdTom)/D2-GFP和Aldh1l1-GFP小鼠的1,208个单侧纹状体细胞的转录组。这1208个单细胞，既有随机捕获的单细胞，也有特异性富集的MSNs和星形胶质细胞的细胞(图1A)。通过tSNE聚类分析（图1B）和已知细胞maker，鉴定出主要的细胞类型 (图1B - 1D)。流式细胞技术富集的aldh1l - gfp小鼠的细胞大多是星形胶质细胞，Drd1- tdtom /Drd2-GFP细胞主要是神经元细胞。然而，无论是tSNE还是 PCA分析（图1B)，都不能分辨出D1和D2两种MSNs，表明它们整体的基因表达模式是相似的。图1. 利用scRNA-Seq对小鼠纹状体进行细胞分类(A)从单个细胞中获得cDNA并测序的实验流程。分离D1-tdTom/D2-GFP和ALDH1L1-GFP小鼠的纹状体切片，FACS或MACS收集细胞。然后在微流控芯片中捕获细胞，成像，并扩增cDNA。(B)使用tSNE对十大类细胞进行无偏聚类，根据细胞表达谱分类细胞。每个点代表一个细胞，并根据聚类算法(DBSCAN)着色。(C)箱线图展示主要细胞类型每个细胞检测到的的基因总数。(D) 根据marker基因，分类出十种主要细胞类型。每个点代表一个细胞，点的颜色代表maker基因的表达比例。(E)与细胞类型高度相关的前50个基因热图。行代表单个细胞，列代表单个基因。右边的横条颜色表示细胞来源。左边的横条表示细胞的DBSCAN聚类结果，底部显示细胞类型。在每个细胞类型50个基因的集合中，基因与该细胞类型相关的p值从左到右递增。
3.2 纹状体MSNs神经元的离散亚型纹状体的神经元组成由大量的D1 MSNs神经元、D2 MSNs神经元和少量的中间神经元组成。使用Mic-scRNA-seq分析了共334个MSNs，这些MSNs既有随机捕获的，也有流式细胞仪富集的。基因成对相关分析结果显示D1 MSNs和D2 MSNs具有特异性表达基因(图2A)。使用FACS-scRNA-seq对五只小鼠的570个MSNs细胞进行测序。根据MSNs D1和D2marker基因的表达情况评分，评分结果呈明显的双峰 (图2B和2C)，表明存在两种亚型:D1 MSNs和D2 MSNs(图2D)。但有一些MSN细胞共表达了多个D1和D2 maker基因，D2-GFP/D1-TdTom双报告基因小鼠纹状体的原位成像发现tdTom和GFP双阳性的MSNs细胞，证实了这一结果。图2 MSN细胞亚型特征(A)层次聚类结果显示MSN中有两个强负相关的基因簇，其中包括D1和D2 MSN已知的maker基因。(B)MSN的rPCA。细胞(行)按其在PC1上的投影排序，基因(列)按其对PC1的正(左)或负(右)贡献排序。区分出三个不同的细胞群，定义为D1 MSN(红色)、D2 MSN(绿色)和D1/2混合MSN(黄色)。(C)单个MSN投射至D1-D2的得分分布。D1-D2得分是通过将(B)中所示的基因的表达量来计算的。D1-MSN和D2-MSN形成不同的峰，新鉴定到的MSN分布在这两个峰之间。(D)D1-MSN和D2-MSN细胞中D1基因(y轴)和D2基因(x轴)的表达情况。点的颜色表示Drd1a的表达比例。(E)D2-GFP/D1-TdTom双报告基因小鼠的矢状脑切片，在伏隔核和背侧纹状体均有tdTom和GFP双阳性MSNs。(F)对D2-GFP/D1-TdTom双报告基因小鼠的纹状体切片进行共聚焦成像，证明在纹状体中存在D1/2共表达的MSN。(G)用基因表达谱对(D)图划分到D1部分的的MSN进行rPCA分析。细胞(行)按其在PC1上的投影排序，基因(列)按其对PC1的正(左)或负(右)的贡献排序。鉴定出两个不同的细胞群，定义为主要的(Foxp1)D1-MSn(红色)和Pcdh8-MSn(黄色)。(H)Foxp1-D1和Pcdh8-MSN细胞的D1基因(y轴)和Pcdh8基因(x轴)表达的双图。点的颜色表示PENKIS的表达比例。(I) MSNs投射到Pcdh8-Foxp1得分的分布。MAJOR-D1和Pcdh8-MSNs形成不同的峰。(J) 箱线图展示Pcdh8和Tacr1在Pcdh8-MSN中与其他类型MSN细胞中的表达情况。(K) (D)图中D2部分MSN细胞的rPCA分析。细胞(行)按其在PC1上的投影排序，基因(列)按其对PC1的正(左)负(右)贡献排序。区分出两种不同的细胞类群，分别为D2 MSN(绿色)和Htr7-MSN(浅绿色)。(L)D2 MSN和Htr7-MSN细胞的Htr7基因(y轴)和Synpr基因(x轴)表达情况。点的颜色表示Tac1的表达比例。(M) MSN投射到Htr7-Synpr上得分的分布。D2-MSN和Htr7-MSN形成不同的峰。(N)箱线图展示Agtr1a与MSN在Htr7-MSN中与其他类型MSN细胞中的表达情况。
3.3 MSN亚型内表达谱呈连续状MSN亚群内的异质性分析显示，Foxp1-D1 MSN中有一个亚群D1-DNER高表达Dner、Cxcl14和Tnnt1，低表达Meis2 (图3A-3C)。在Synpr-D2 MSN有一小部分细胞表达Cartpt和Kcnip1，但缺乏Calb1的表达(图3G-3H)。MEIS2+/DNER- 型的D1 MSN亚群的表达谱呈连续状(图3D)，投射到Cnr1-Crym上的得分分布也呈现单峰 (图3E)。其他主要MSN亚型基因表达谱的rPCA分析显示出的变化情况类似(图3J-3R)。图3. MSN亚型异质性鉴定(A) 基因表达谱rPCA分析显示D1-DNER MSN分为不同的亚群。(B) D1 MSN投射至Meis2-Dner基因上的得分分布。(C) D1-MSN和D1-Dner MSN细胞中D1-Meis2基因(y轴)和D1-Tnnt1基因(x轴)的表达情况，点的颜色表示细胞表达Meis2和Tnnt1的比例。(D) MSN基因表达谱rPCA分析，表明D1 MSN 细胞中Cnr1和Crym的表达量变化相反(E)D1 MSN投射到Cnr1-Crym上的得分分布。(F)D1 MSN中Crym基因(y轴)和Cnr1基因(x轴)的表达情况。点的颜色表示细胞表达Cnr1和Crym的比例。(G) D2 MSN表达谱rPCA分析，(H) D2 MSN投射至Calb1-Cartpt基因上的得分分布。D1 MSN中Crym基因(y轴)和Cnr1基因(x轴)的表达情况。点的颜色表示细胞表达Cnr1和Crym的比例。(I) D2-Calb1和D2-Cartpt MSN中Cartpt基因(y轴)和Calb1基因(x轴)的表达请情况。点的颜色表示细胞表达Calb1和Cartpt的比例。(J) D2 MSN表达谱rPCA分析，表明D2 MSN 细胞中Cnr1和Crym的表达量变化相反(K)D1 MSN投射到Cnr1-Crym基因上的得分分布。(L)D1 MSN中Crym基因(y轴)和Cnr1基因(x轴)的表达情况。点的颜色表示细胞表达CCnr1和Crym的比例。(M) Pcdh8-MSNs表达谱rPCA分析显示， Cnr1和Wfs1在Pcdh8-MSNs细胞中表达量变化相反。(N) Pcdh8-MSN投射到Cnr1-Wfs1上的得分分布。(O)Pcdh8-MSNs中Wfs1基因(y轴)和Cnr1基因(x轴)的表达情况。点的颜色表示细胞表达Cnr1和Wfs1的比例。(P)Htr7-MSNs的表达谱rPCA分析显示，Cnr1和Th在Htr7-MSNs中表达量变化相反。(Q)Htr7-MSNs投影到Cnr1-Th上的得分分布。(R)Htr7-MSNs中Th基因(y轴)和Cnr1基因(x轴)的表达情况。点的颜色表示细胞表达Cnr1和Th的比例。
3.4 纹状体非神经元细胞分类接下来，作者描述了血管细胞、免疫细胞、少突胶质细胞和星形胶质细胞的异质性。在血管细胞分为两个离散的亚群：血管平滑肌细胞群和内皮细胞群 (图4B和4C)。免疫细胞也分为两个离散的亚群：小胶质细胞和巨噬细胞 (图4D-4F)。在少突胶质细胞中，也鉴定出了两个细胞亚型：一组表达NFasc的新形成的少突胶质细胞(NFO)，一组表达KLK6的成熟少突胶质细胞(MO)。还有一个亚群同时表达NFO和MO细胞的marker基因，可能是过渡细胞群(图4H和4I)。星形胶质细胞没有发现不同亚群(图4J)。图4血管细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特征(A)层次聚类表明血管细胞分为两大亚型。(B)43个纹状体血管细胞的rPCA分析鉴别出两个不同的亚群，表达Myl9和Tagln的血管平滑肌细胞和表达Ly6e和Pltp的内皮细胞。(C)血管细胞PC1评分直方图呈明显的双峰，表明血管细胞存在两种不同的亚型。(D) 层次聚类表明免疫细胞分为两大亚型。(E)119个免疫细胞(小胶质细胞和巨噬细胞)的rPCA分析鉴别出两个不同的亚群，表达SPARC的小胶质细胞和表达MRC1的巨噬细胞。(F) 免疫细胞PC1评分直方图呈明显的双峰，表明血管细胞存在两种不同的亚型。(G) 层次聚类表明少突胶质细胞分为两大亚型。(H) 43个少突胶质细胞的rPCA分析鉴别出两个不同的亚群，表达KLK6和Sec11c的MOS和表达NFasc和CKB的NFO。也有相当数量的少突胶质细胞共表达这两组基因，它们可能是NFO和MOS之间过渡细胞。(I)少突胶质细胞PC1评分分布直方图。MO和NFO细胞形成两个峰，过渡细胞给予这两个峰之间。(J)星形胶质细胞内基因之间的相关性较低。(K)107个单个纹状体星形胶质细胞的rPCA分析没有鉴别出不同的亚群。细胞(行)按其PC1得分排序，基因(列)按其PC1负载排序。星形胶质细胞高表达与突触通讯相关的基因(Slc6a11、Slc6a1、Slc6a9、Gria1和Gria2)、与翻译相关的基因(Rpl9、Rpl14、Rps5和rpsA)和细胞极性调节因子(Cdc42) 。(L)星形胶质细胞PC1评分直方图呈单峰，表明纹状体星形胶质细胞内不含离散的亚型。
3.5 不同细胞类型特异性转录因子使用相关分析来识别在不同类型细胞中特异性表达的TF(Spearman相关系数>0.5)，得到69个特异性表达的转录因子，纹状体神经元的特异性TF为其中最大的一组 (22)。其中，SP9在MSN中的作用从未被报导过，作者分析了SP9过表达对纹状体原代培养细胞中MSN标志物表达的影响。结果显示SP9过表达显著降低了Drd1a的表达，而对D1 MSN maker基因Tac1、Pdyn和D2MSN maker 基因Drd2的表达无明显影响。这些结果表明，SP9的过表达可能扰乱D1 MSN的正常发育。图5.通过单细胞转录组分析鉴定不同类型细胞特异性的TF(A)细胞类型与特异性TF之的相关性。(B)不同细胞类型最特异的TF的表达比例。点的颜色来表示基因的表达比例。
3.6 细胞类型中特异性的可变剪切选择性剪接是产生转录多样性的关键机制。作者使用相关性分析来识别在不同类型细胞中特异性表达的剪接因子，结果显示，神经元的可变剪接多样性高于纹状体中的其他细胞类型。作者通过对剪接位点上外显子连接的READ映射确定了45,843个选择性剪接位点。使用Fisher’s exact test定义了在一种或多种细胞类型(图7A和S7A)中差异剪接的位点。许多细胞同时表达主次要剪切体，定义为复合剪接(图7A和S7A-S7D)。根据细胞类型对带有复合剪接位点的基因进行量化和比较，在纹状体的免疫细胞中检测到很少的复合剪接位点，但在神经元以及神经干细胞、少突胶质细胞和分泌室管膜细胞中检测到较多的复合剪接位点，证实了神经元的可变剪接多样性更高。图6：单细胞转录组分析鉴定神经元特有的剪接因子(A)不同类型细胞中特异性剪接因子成对基因相关性的层次聚类。(B)剪接因子作为marker基因的纹状体细胞tSNE图，神经元的marker基因剪接因子Celf4和RBFOX1，少突胶质细胞的marker基因为剪接因子Pcbp4。
4讨论作者通过scRNA-seq将 MSN 细胞、血管细胞、免疫细胞和少突胶质细胞细分为多个亚群，并确定了大量亚型特异性maker基因(图4A-4L)。作者还确定了细胞类型特异性表达的TF(图5A和5B)。并发现D2 MSN特异性TF SP9会抑制D1 MSN特异性基因Drd1a的表达，最后，作者观察到神经元对大脑独特的高水平选择性剪接的贡献最大，神经元表达更多特定的剪接因子，同时，神经元中选择性剪接的整体复杂性高于其他类型的细胞。
5marker基因列表
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